Sanger测序不同试剂对DNA测序的影响
现在试剂以及设备已经取得了巨大的进步，但是DNA测序依旧需要相当的实验技能。实验技能主要来自于对技术本身的了解，在实验过程中做出相应的调整，如何正确的调整实验过程中的参数是本章节需要讨论的重点。
本研究就实验室试剂对测序结果的影响，这些试剂可主要是用于质粒DNA模板的制备、PCR产物纯化、引物合成以及其他的实验操作对测序结果影响。
使用0.5ug的pGem3zf和1ul 5uM M13反向引物，实验的方法如下：将DNA、引物、待测试试剂、水共计7ul，98℃热变性7分钟，之后至于冰上，将3ul的测序酶MIX加入（酶和buffer按照1:3稀释）共计10ul体系，其中Mgcl2的浓度为2mM。PCR程序为96℃ 10S、50℃ 5S、60℃ 4min，30个循环。测序反应产物使用醇沉法去除多余染料，每个样品做3到6次平行测试，上机测序。
镁离子是刺激聚合酶的活性的重要成分，对于DNA聚合酶，最佳的浓度是2mM。
图2.1 镁离子浓度对测序结果的影响。
EDTA是一种金属离子螯合剂，它能够有效的降低游离镁离子的浓度，镁离子又是聚合酶的活性的重要成分，当EDTA与Mgcl2的摩尔比接近1:1的时候，几乎所有的酶活性都被抑制。一些DNA制备的方法里面，TE作为DNA的保存溶剂，这个是必须要注意的问题。DNA在水中短时间是可以的，但是长时间保存存在很多问题，所以建议降低TE中的EDTA水平，如0.01mM。
图2.2 EDTA浓度对测序结果的影响。
DNA在制备过程中会使用到各种盐类，他们的存在会对测序结果产生重大的影响，下图罗列了一些盐类对测序读长的影响，在非常低的浓度下（＜2.5mM），盐对测序读长没有明显的影响，较高的盐存在的条件下，会对测序读长产生明显的影响，如盐的含量如果在25mM时，测序读长会减少20%到50%，在100mM时（乙酸铵除外），测序反应则被完全抑制了。
不同盐类对测序结果的影响，乙酸铵（●）、氯化铯（□）、氯化钾（×）、乙酸钠（◇）、氯化钠（△）
在测试过程中可以直接或者间接的使用多种其他的试剂，下图显示了二甲基亚砜（DMSO）、醇类、乙酰胺（经常被用于高GC模板）、乙腈（用于引物合成）、甘油等对测序的影响，浓度在5%的DMSO、乙酰胺、甘油、乙腈对测序读长没有影响，即使10%也没有明显影响，只有在15%的时候才会出现读长显著减少。乙醇和异丙醇在浓度5%的时候测序读长减少了一半。氨的作用比较强烈（引物合成最后一步使用到），0.25%则可以抑制60%的活性，1%则可以完全抑制测序反应。
不同试剂对测序的影响,乙酰胺（●）、乙腈（◇）、DMSO（□）、乙醇（△）、甘油（◆）、异丙醇（×）
DNA以□表示、RNA以△表示
在一般的测序反应中，至少需要25个以上的循环才能够产生足够多的片段信号被测序仪读取，因此引物与模板的比值至少为25:1，如引物和模板的比值为25:1，设置循环为30个的话，不会提高数据的质量和长度。同时，如引物和模板的比值为50:1，设置热循环数量为25也不会提高数据的质量和长度。
